Annual Review of Phytopathology (2024)｜工程化打造“同一健康”超级小麦

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摘要：小麦是全球首要作物，为人类饮食供给约 20% 的蛋白质和热量。但是，由于病虫灾和非生物钳制，小麦的产值潜力遭到束缚。虽然传统育种已改善了一些抱负性状，但与玉米、大豆等其他作物比较，现代转基因技能在小麦中的运用遭到束缚。小麦基因克隆和转化技能的最新开展，现在使得培养符合可继续性、粮食安全和环境办理等 “同一健康” 方针的超级小麦成为或许。该种类结合了增强病虫灾抗性、前进谷物养分价值以及前进对气候改动的适应才能等特性。在本总述中，作者评论了运用现有技能将有用性状组合并转化到小麦中的办法。作者还触及了育种者的需求以及专利和监管等法令方面的考虑要素。

要害词：小麦、普通小麦（Triticum aestivum）、抗病性、抗逆性、基因润饰、转基因作物

1. 导言

至少在 14400 年前，约旦区域就有人搜集野生小麦先人的麦粒并将其加工成烘焙食物，而小麦在 4000 年后于新月沃地被驯化。这使得农人可以掌控粮食出产，然后催生了久居型社会，敞开了文明的开展进程。现在，普通小麦（Triticum aestivum）是地球上栽培最为广泛的作物，它与全球的前史、文明、宗教以及政治等许多方面严密交错在一起。现在，小麦年产值超越 7.5 亿吨，为全球供给了五分之一的热量和蛋白质摄入。大约有 2.8 亿吨小麦谷物经过世界边境出口到 90 多个国家，价值达 585 亿美元。阿根廷、澳大利亚、保加利亚、加拿大、法国、印度、罗马尼亚、俄罗斯、乌克兰和美国这十个国家掌控着四分之三的小麦贸易量，这凸显了小麦与政治以及全球经济之间的彼此相关。

小麦的出产和消费面对着许多可继续性及健康方面的应战。传统的小麦栽培一般需求很多耗能的化肥和农药。虽然很多施用农药，但由于病虫灾的影响，估量每年小麦产值仍会削减约 21%（2 亿吨）。由于这种产值丢失一般发生在作物成长季的后期，也就是在施用农用化学品之后，这意味着巨大的动力糟蹋，估量达 4200 亿千瓦时，相当于 120 艘装满原油的油轮所包含的能量。

非生物钳制也严峻束缚了小麦的栽培，其间水分亏缺被视为最为要害的要素之一。在许多区域，小麦依托从地下蓄水层中不行继续地抽取水源进行灌溉，而在非灌溉的干旱环境中，降雨的不规则束缚了小麦产值。虽然小麦在人类饮食中十分重要，但它或许缺少某些微量养分素，比方铁和锌，并且会使易感人群患上乳糜泻。小麦出产、消费以及粮食安全方面面对的这些应战与“同一健康” 概念相符合，该概念倡议选用一种全面且可继续的办法来保证人类福祉以及维护环境。

很多生物技能东西为应对“同一健康” 理念下小麦出产所面对的应战供给了潜在途径。虽然长期以来环绕转基因（GM）小麦存在着许多社会政治方面的阻挠，但阿根廷近期同意了耐旱的 HB4 小麦种类，这显现了商业化转基因小麦的潜力。在本总述中，作者将评论打造一种 “同一健康” 超级小麦所触及的技能应战，这种超级小麦需将比如 HB4 耐旱性这类非生物抗逆性状与抗病性以及养分质量前进等性状相结合。作者还会审视束缚克隆小麦抗病（R）基因运用的、有时较为扎手的专利状况，以及这一状况怎么既对构建耐久抗性构成潜在应战，又带来相应机会。此外，作者也会探究一些办法，经过这些办法可以将符合“同一健康” 方针的多个显性性状整合到小麦基因组的一个位点上，以便在育种方案中促进它们的一起遗传。

2. 构建生物抗性可前进小麦产值

植物所面对的生物钳制是由种类繁复的生物形成的，这些生物包含真菌、细菌、病毒、类病毒、昆虫、线虫、蛛形纲动物以及杂草。这些生物会损坏寄主安排并掠夺植物成长必需的养分物质，然后导致植物生机下降乃至逝世。在农业范畴，生物钳制在作物收成前和收成后的丢失方面都起着重要效果。在已记载的近 200 种病虫灾中，有 50 种由于其对农作物形成危害以及影响农人收入的潜在或许性，被以为具有重要的经济影响。如前文所述，全世界估量的小麦产值中约有 21% 因病虫灾而丢失。

很多真菌病害会影响小麦并形成具有重要经济影响的丢失，包含条锈病、叶锈病、秆锈病、白粉病、赤霉病（FHB）、褐斑病、冠腐病和根腐病以及小麦麦瘟病。将真菌病害导致的产值丢失降至最低的两种首要途径是施用内吸性杀菌剂以及培养抗病种类。施用杀菌剂或许会引创造显的负面次生效应，例如促进抗药性病原体呈现、有利的土壤菌根真菌数量削减以及对人类健康发生晦气影响。运用具有遗传抗性的种类是最可继续的处理方案，但正如作者下文即将评论的那样，这需求叠加抗病（R）基因，以应对病原体战胜单个小种特异性R基因的才能。

束缚小麦产值的首要害虫有蚜虫、麦二叉蚜和叶蝉。其间，俄罗斯麦蚜和禾谷缢管蚜最为重要，在严峻发生虫灾时，它们可导致高达 40% 的产值丢失。此外，蚜虫仍是致病性病毒的重要传播媒介。植物针对害虫的防护可分为三类：（a）由能将危害降至最低的遗传要素所介导的耐受性；（b）抗生性，即一种经过形状或化学机制阻挠害虫取食的机制；（c）抗虫性，它会搅扰害虫的健康状况和繁衍才能。

对小麦作物免受虫灾的维护首要是经过杀虫剂和抗病种类相结合的办法来完结的。在一些作物中，转基因技能现已彻底改动了害虫防治办法，例如培养出了能发生苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的杀虫蛋白 Bt 的转基因种类。全球 Bt 作物的栽培面积从 1996 年的 110 万公顷明显扩展到了 2019 年的 1090 万公顷。但是，与含有单个 R基因的种类相同，Bt 抗性依托于单个基因的表达。这会施加较高的选择压力，然后促进 Bt 抗性害虫呈现，其数量从 2005 年的 5 例添加到了 2020 年的 26 例。

2.1. 基因组学开展推进了 R基因克隆

R基因是一种天然或诱导发生的遗传元件，可以赋予植物对害虫或病原体可检测的抗性。在普通小麦中现已判定出超越 467 个 R基因，其间 42% 是从普通小麦基因库之外导入的。在已被克隆的 450 多个植物 R基因中，绝大多数编码细胞外表免疫受体（占 17%）或核苷酸结合富含亮氨酸重复序列（NLR）类的细胞内免疫受体（占 55%）。这些蛋白质可以直接或直接辨认病原体分子的存在，并发生构象改动以发动防护反响。

R基因的克隆一般始于经过对遗传杂交进行性状剖析来检测该基因。运用特征清晰的遗传符号将基因的方位定位到抗性亲本的物理序列上，然后经过注释和基因表达研讨对该序列细心选择候选基因。终究，经过敲除（例如，运用甲基磺酸乙酯（EMS）等化学诱变剂或 CRISPR - Cas9 等基因修改东西）或敲低基因表达（例如，经过病毒诱导的基因缄默沉静）的办法对候选 R基因进行功用测验。抱负状况下，还需在感病布景下进行瞬时或安稳表达，以供认该基因除了是抗性所必需的之外，是否足以发生抗性。

多年来，小麦R基因的别离遭到小麦基因组杂乱性的阻挠，小麦的六倍体基因组（2n = 6x = 42）不只巨大（16Gb），并且包含很多重复序列（占 85%）。在许多定位克隆项目中，天然染色质与引进染色质之间受按捺的重组更是使状况变得杂乱。因而，从前克隆一个小麦R基因被视为一项艰巨的使命，需求消耗多年时刻并投入很多资源。首个被克隆的小麦R基因是 2003 年的 Lr21，大约在从玉米（Zea mays；1992 年的 Hm1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana；1994 年的 Rps2）和西红柿（Solanum lycopersicum；1994 年的 Cf - 9）中别离出第一批R基因的十年后。

在随后的几年里，额定的小麦R基因克隆作业起先开展缓慢，但高通量 DNA 测序、生物信息学的改善以及下降基因组杂乱性的技能一起加快了这一进程。例如，R基因富集测序（RenSeq），即对 NLR 基因库进行外显子组捕获和测序，被运用于多个由 EMS 诱变发生的突变体（MutRenSeq），然后完结了对赋予小麦秆锈病抗性的 Sr22和Sr45这两个R基因的快速克隆。尔后不久，桑切斯 - 马丁（Sánchez - Martín）及其搭档用染色体流式分选和测序（MutChromSeq）代替了 RenSeq，使得可以不受重组束缚、无倾向性地克隆任何小麦基因，仅需一系列等位基因突变体即可。运用这些基因组学技能，到现在，已完结了至少 14 个小麦 R基因的克隆。

最近，DNA 测序本钱的继续下降促进了依据相关遗传学的 R基因快速克隆，该办法依托 RenSeq 以及对包含数百份小麦及其野生近缘种的大型、遗传多样性集体进行全基因组鸟枪法测序。在 2019 年和 2022 年，运用这种办法从粗山羊草（Aegilops tauschii，一种作为小麦 D 基因组来历的野生草本植物）中克隆出了 Sr46、SrTA1662（Sr66）秆锈病抗性基因以及WTK4白粉病抗性基因。在 2023 年，相同的办法被用于从二倍体小麦近缘种巨大山羊草（Aegilops longissima）中克隆出Lr/Yr548叶锈病和条锈病双抗性基因，从小麦中克隆出束缚小麦瘟病菌寄主规模的Rwt3和Rwt4基因、小麦瘟病抗性基因Rmg8以及小麦叶枯病（Septoria tritici blotch）抗性基因Stb15。

测序及全基因组拼装方面的改善，连同 Illumina 短读长、PacBio 以及牛津纳米孔技能（ONT）长读长测序技能，已被用于从小麦及其若干野生近缘种中生成带着方针 R基因的参阅样本。这有助于从沙融山羊草（Aegilops sharonensis）中克隆出Sr62秆锈病抗性基因、从小麦中克隆出Yr27条锈病抗性基因以及从二粒小麦（Triticum dicoccoides）中克隆出Pm69白粉病抗性基因。这些先进的测序技能也被用于生成小麦和粗山羊草的泛基因组，有助于从小麦中别离出抗麦红吸浆虫（orange wheat blossom midge）的 Sm1基因以及从粗山羊草中别离出抗叶锈病的Lr39基因。

最近， Brabham及其搭档构建了一个包含 995 个 NLR 基因的文库，这些 NLR 基因安稳转化到了小麦中。这些 NLR 基因是依据其抗性特征和 NLR 基因表达状况从 18 种小麦野生近缘种中别离出来的。经过这种办法，他们成功判定出了 4 个在田间供给秆锈病抗性的基因。在曩昔十年里，测序和功用基因组学技能的严峻改善明显加快了小麦 R基因的克隆作业，到现在，已有超越 70 个 R基因被别离出来。这些改善将有助于把R基因引进到优秀小麦种类中。

2.2. 基因叠加可使小麦取得耐久的生物抗性

单个R基因会对病原体施加较高的选择压力，这有利于发生能打破抗性的小种，终究使该R基因失效。出于这个原因，要点一向放在引进多基因叠加组合上。例如， Luo等人运用载体构建方面的开展以及已克隆的秆锈病（Sr）R基因的可获取性，将 5 个 Sr基因叠加导入易感染锈病的普通小麦栽培种类 Fielder中，使其对 7 种锈病小种发生了广谱免疫。这样的多基因叠加组合应该更具耐久性，由于病原体难以发生能一起战胜叠加组合中一切基因的变异体。跟着叠加的基因数量增多，病原体战胜抗性就变得越发困难。此外，叠加组合能使多个基因在代代传递进程中始终保持在一起，避免了意外的别离状况，并且在单个位点上存在叠加基因使得它们在育种方案中能更简洁地在不同种类间搬运（图 1）。

图1. 转基因与惯例育种的抗病基因叠加比照

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虽然针对小麦的首要病害现已克隆出了许多R基因，例如，有 19 个 Sr基因、10 个条锈病（Yr）基因、13 个叶锈病（Lr）基因以及 20 个白粉病（Pm）基因，但关于其间的大部分（62 个中的 55 个）而言，其有用性要么较差，要么尚无相关记载，这阻挠了有用的基因叠加作业。基因的有用性可以经过将单个基因转入感病布景中，然后运用全球搜集的病原体别离小种对所得的转基因植株进行检测来评价。与此一起，已克隆的Sr、Yr和Lr基因现有的部分有用性信息可用于规划开始的基因叠加组合，以构建针对秆锈病、条锈病和叶锈病的耐久抗性。比较之下，已克隆的Pm基因一般有用性较差，要构建一个具有耐久白粉病抗性的基因叠加组合，最多只能算是一种碰运气的做法。

基因叠加面对的另一个应战是部分抗性性状具有数量性状的特色。例如，小麦赤霉病（FHB）抗性遭到多个具有微小到中等效应的基因影响。到现在，现已描绘了 7 个小麦赤霉病抗性基因：源自小麦的 Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5，以及来历于其野生近缘种的Fhb3、Fhb6和Fhb7。但是，只要Fhb1和Fhb7已被克隆，并且关于Fhb1的实在身份还存在疑问。关于稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，即小麦瘟病菌）而言，小麦基因库中可用的抗性资源有限，迄今仅判定出 11 个 R基因。现在，只要编码丝氨酸 - 苏氨酸激酶 MCTP（含多个 C2 结构域和跨膜区域蛋白）的 Rmg8基因已被克隆。关于赤霉病和小麦麦瘟病来说，都需求更多已克隆的基因来构建基因叠加组合。

对昆虫的抗性往往是数量性状，因而在构建基因叠加组合时会存在问题。但是，经过将具有不同效果形式的 Bt 变体与针对害虫的显性抗生性基因（如针对麦二叉蚜的 H16和H17基因、针对麦红吸浆虫的Sm1基因以及针对俄罗斯麦蚜的Dn7基因）进行聚合，可以在小麦中完结对害虫有用且耐久的抗性。

检测多基因叠加组合的功用面对着严峻应战，由于多个R基因之间的上位性效果会阻挠在害虫或病原体病害检测中对单个基因有用性的供认。要战胜这一困难，需求克隆出叠加组合中每个R基因所辨认的相应害虫或病原体效应子。克隆的效应子可以经过异源表达检测（例如运用病毒）或许原生质体瞬时检测等办法逐一进行导入检测。效应子克隆作业落后于R基因克隆，这或许是由于许多小麦病原体具有专性活体养分型的特色。不过， Arndell及其搭档最近建立了一个高通量的小麦原生质体体系，用于选择来自小麦秆锈病菌（Puccinia graminis f. sp. tritici）的候选效应子文库，并敏捷克隆出了AvrSr13和AvrSr22基因。这一令人振奋的办法为体系克隆小麦R基因所辨认的一切用应子、为小麦首要病害供给抗性带来了很大的期望。

3. 构建非生物抗逆性以应对负面环境影响

全球小麦产值因干旱、极点温度、盐碱、氧化钳制、养分缺少以及土壤毒性等非生物钳制而下降。在曩昔几十年里，这些钳制的强度和发生频率继续添加，对植物成长、产值以及籽粒质量发生了负面影响。基因工程已前进了玉米、棉花和大豆的抗逆性，但在培养抗逆性转基因小麦种类方面开展有限。虽然有几项研讨已成功培养出显现出抗逆性增强的小麦种类，但在试验室中调查到的抗性性状并不总是能在田间条件下体现出来。例如，在小麦中过量表达拟南芥转录因子AtDREB1A，虽然在试验室中前进了干旱存活率，但在田间试验中却未见成效。此外，非生物钳制抗性的增强往往伴跟着成长和产值的下降，一些触及小麦转录因子过量表达的研讨也报导了这一状况。

对转基因介导的小麦抗逆性状进行田间评价的状况依然较少，部分原因是一些区域需求严厉的生物安全措施。因而，只要少量技能经过了田间试验验证。一个比如是 IND - ØØ412 - 7 小麦品系，它经过基因工程改造后具有更强的耐旱性。水分亏缺是包含小麦在内的许多农作物面对的最具损坏性的钳制之一，所以在不影响产值的状况下增强耐旱性是一项备受等待的性状。在阿根廷 37 个田间试验点的田间试验中，带着来自向日葵（Helianthus annuus）的HaHB4转录因子的 IND - ØØ412 - 7 小麦品系，相较于野生型，其水分运用功率（单位降雨量所发生的产值）前进了 9%，产值前进了 6%。当仅考虑那些受水分亏缺束缚的环境时，IND - ØØ412 - 7 在相对水分运用功率方面（前进 14%）和产值方面（前进 16%）展示出了更大起伏的添加。值得注意的是，在不存在水分亏缺的状况下，并未调查到产值丢失（图 2）。这项技能已在南美洲进入商业化阶段，2022 年在阿根廷有 5 个被命名为 HB4 小麦的种类完结注册。

图2. HB4 小麦在试验室和田间条件下赋予小麦的耐旱性

在另一项耐旱性研讨中，运用 430 份小麦资料进行全基因组相关剖析，发现转录因子 TaNAC071 - A的表达与严峻干旱后的存活率之间存在强相关性。在水分有限条件下进行的一次包含三次重复的田间试验中，对过量表达TaNAC071 - A的株系进行测验，效果显现其抗逆性明显前进，与 CRISPR 敲除株系、RNA 搅扰（RNAi）敲低株系或野生型株系比较，其穗长、穗宽、籽粒长度、籽粒宽度以及产值均有所添加。经过表达来自大肠杆菌（Escherichia coli）的润饰冷休克基因SeCspA，以及在老练和水分亏缺或开花和变老期间特异性激活的发动子调控下过量表达细胞分裂素生物组成基因IPT，也完结了干旱条件下田间产值的添加。

土壤中很多元素磷和氮的缺少以及有毒化合物的存在往往会束缚产值，因而它们是生物技能干涉的重要方针。在谷子（Setaria italica）中，SiATG8a 是一种参加自噬信号传导的类泛素蛋白，被供认为在低磷条件下前进籽粒产值的潜在候选基因。对转 SiATG8a基因小麦进行的田间试验显现，在标准条件下产值前进了 0.06 - 11.8%，在低磷条件下产值前进了 4.37 - 23.5%。大多数植物（包含小麦）无法直接运用分子态的二氮，而豆科植物可以经过其根部含固氮菌的根瘤获取这种氮。由多个组织组成的 “农业中完结养分共生” 联盟旨在将这种共生才能引进包含小麦在内的谷类作物中。

4. 经过改造小麦有利养分性状可前进人类健康

小麦的转基因改进可不只仅束缚于增强其对生物和非生物钳制的抵抗力。小麦含有多种重要养分成分：碳水化合物（75% - 80%）、蛋白质（9% - 18%）、膳食纤维以及比如维生素、钙、铁和锌等微量养分素。但是，小麦也缺少足量的几种对人类健康至关重要的养分素，包含维生素 A、维生素 B12、维生素 C、大部分脂肪、若干微量养分素以及必需氨基酸赖氨酸。必需维生素和矿物质摄入缺少会危及人类健康和开展，世界卫生安排指出，全球约有 20 亿人存在养分素缺少问题，南亚和撒哈拉以南非洲区域受影响尤为严峻。

由于很多人群存在铁和锌膳食缺少的状况，铁和锌遭到了极大重视。经过育种来前进籽粒中铁和锌的含量较为杂乱，由于像土壤成分这类环境要素会对这些养分素的含量发生严峻影响。另一个重要考量要素是矿物质的生物运用率。例如，小麦籽粒中的植酸会与钾、镁、锰、铁、钙和锌等矿物质结合，下降它们在消化道中的吸收。下降籽粒中植酸的含量或增强植酸酶的活性，可以前进这些矿物质的生物运用率。在小麦中表达一种热安稳的微生物植酸酶基因变体，使内源性植酸酶活性前进了 5 - 6 倍，并且在面粉经过热处理后仍保留了部分活性。在另一项研讨中，经过转基因表达水稻基因 OsNAS2（该基因编码一种能发生氨基酸—— 烟酰胺的酶，烟酰胺是一种锌和铁的螯合剂），使小麦籽粒中的锌和铁含量前进了 2 - 4 倍。

关于小麦的另一个重要膳食考量要素是其较高的麸质含量，麸质会使具有麸质不耐受遗传易理性的个别患上乳糜泻。基因工程已被用于消除、下调或去除小麦中如α- 麦胶蛋白等麸质蛋白的毒性，旨在培养出能削减对麸质灵敏个别发生负面影响的种类。当经过 RNA 搅扰（RNAi）技能下调转基因株系中的 α- 麦胶蛋白基因时，α- 麦胶蛋白的含量下降了 60% 以上。运用 RNAi 下调方针基因，可以以显性的办法针对本来为隐性的性状进行操作，并且有或许将其归入基因叠加组合中。

近期关于遗传力的研讨标明，不同小麦种类在各种维生素及其他养分素含量方面存在遗传多样性，这为培养更具养分的小麦种类供给了名贵的原资料。小麦参阅基因组序列的发布、蛋白质组学和代谢组学的前进以及转基因技能的运用，为加快培养改进种类、前进小麦养分价值和健康效益带来了令人振奋的机会。

5. 超级小麦工程技能可完结 “同一健康” 方针

基因转化可以将所需基因定向整合到宿主基因组中，然后加快育种作业，并战胜有性不亲和的天然妨碍。小麦遗传技能的最新开展为打造超级小麦拓荒了宽广途径。但是，这些作业有必要精心规划，要将体外构建基因叠加组合以及高效转化整合为一种协同战略，以最大程度削减单个转基因的别离状况，并便于后续的育种作业（图 3）。

图3.保证转基因事情共别离的转化战略

体外构建基因叠加组合有多种办法，每种办法各有优缺陷。最常用的体系有 Gateway、Gibson 和 Golden Gate。Gateway 克隆已展示出极高的功率。但是，一个明显的束缚在于它首要是二元性质的，触及将单个刺进片段搬运到新的序列环境中。这一束缚经过开发多刺进位点的 Gateway 体系（如 Multisite Gateway Pro）得到了部分战胜，该体系可以将多达四个 DNA 片段组合到一个方针质粒中。Gibson 拼装技能经过在单管反响中无缝衔接具有相同的 20 - 30 个碱基对结尾的线性 DNA 片段，战胜了上述束缚。因而，与 Gateway 体系中的重组位点不同，其交融位点不存在任何非天然序列。并且，Gibson 拼装具有拼装长达数百千碱基序列的才能。不过，由于在组合的序列片段中需求运用相同的结尾，这就束缚了 DNA 模块的重复和多样化再运用。

依据 Golden Gate 克隆的分层 DNA 拼装战略应运而生，以应对这一应战。与此一起，植物研讨范畴内呈现了三个备受喜爱且被广泛选用的标准 ——GreenGate、GoldenBraid和模块化克隆（Modular Cloning）。这些体系都依托于由 II 型束缚性内切酶发生的标准化的 4 个碱基对的杰出结尾。这些杰出结尾可作为转录构建模块（包含发动子、编码序列和终止子）之间的交融位点。在对这些构建模块进行初始克隆后，所创立的模块会被拼装成转录单元。关于更杂乱的构建体，可以经过另一轮 Golden Gate 反响来拼装多个基因。该体系为基因叠加供给了看似无量的潜力，其仅有的束缚在于受体载体的巨细。但是，依据 Golden Gate 的 DNA 拼装受限于需求从克隆序列中去除 II 型束缚性内切酶辨认位点。虽然这些内部辨认位点在蛋白质编码序列中或许不成问题，但关于像发动子这类非编码序列而言，它们存在所带来的影响往往是不行猜测的。

直到最近，仅有高效的小麦转化技能是由钟渊化学（Kaneka，前身为日本烟草公司）请求专利的，再加上需求贵重的专业培训、授权以及特定载体，这构成了很高的准入门槛，使得该技能仅束缚于少量公立和私立组织运用。不过，最近开发出了一种开源的、可高效进行农杆菌介导转化的代替办法。在运用该技能的一起，共转化小麦转录因子 GRF4及其辅因子GIF1以促进再生，可将转化功率从约 5% 前进到 77%。最近，经过在农杆菌中表达丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的 III 型分泌体系来传递可以阻断植物根底免疫的效应蛋白 AvrPto，小麦的转化功率从 16% 前进到了 63%。现在存在一种风趣的或许性，即可以将这两种技能结合起来，以完结更高的转化功率。

转化功率还受二元载体拷贝数以及 T - DNA 刺进片段巨细的影响。在前进首要谷类作物中小 DNA 片段（最大达 30kb）的转化功率方面现已取得了严峻开展。但是，较大片段（最大达 100kb）的搬运依然是个问题，由于 T - DNA 尺度的添加会导致感染前生成的 T - DNA 链数量削减。经过延伸对农杆菌的乙酰丁香酮处理时刻，可以添加 T - DNA 链的堆集，这或许可以前进大转基因片段的转化功率。

转化多基因叠加组合可保证共别离，并便于在后续育种方案中在不同种类间传递多基因性状（图 1）。但是，一个叠加组合所能带着的基因数量遭到二元载体巨细束缚以及农杆菌将大的 T - DNA 导入宿主基因组才能的两层束缚。要培养出包含上述一切抱负性状的超级小麦，就需求对多个基因叠加组合进行转化。反过来，这就要求施行一种能保证一切叠加组合共别离的战略。在此，作者考虑两种办法，作者将其称为（a）随机整合法和（b）靶向基因叠加法。

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在随机整合法中，各个基因叠加组合被随机转化到小麦基因组中。经过将高效转化与高通量的 T - DNA 刺进位点判定相结合，可以选择出在遗传上严密相邻的整合事情（图 3a）。由于基因组中不同区域的重组频率并不均匀，束缚转基因别离的最大物理间隔会因它们所刺进的染色体以及染色体区域的不同而有所改动（图 3b）。依据对二倍体一粒小麦中 15919 个重组断点的序列剖析，大约 50% 的小麦基因组（即着丝粒和近着丝粒区域）很少发生重组。经过对用 200062 个单核苷酸多态性符号进行基因分型的 371 份六倍体小麦地方种类的前史重组（连锁不平衡）状况进行检测，也印证了这一调查效果。因而，有理由预期经过接连多轮的转化，可以完结在同一个重组冷点进行 T - DNA 刺进。

靶向基因叠加规律运用了现有的各种可完结转基因准确、靶向整合的技能。例如，在存在与靶区域两边区域具有同源性的 DNA 模板的状况下，CRISPR - Cas 诱导的双链断裂可经过同源定向修正完结整合（图 3c）。但是，在植物中，经过该途径进行 DNA 危害修正的频率较低，导致整合功率也较低。最近，经过将引导修改（prime editing）与位点特异性重组酶（SSRs）相结合，战胜了这一束缚。引导修改是一种准确的基因组修改技能，无需制作双链断裂就能对碱基进行改动以及发生短的 DNA 刺进或缺失。位点特异性重组酶可以依据特定的重组位点介导两个 DNA 分子之间的 DNA 交流。在一项结合这些技能的研讨中，先运用引导修改在方针方位创立一个位点特异性重组酶的重组位点，然后运用位点特异性重组酶将一个 11.1kb 的供体 DNA 片段整合到水稻基因组中（图 3c）。这种办法的首要缺陷在于需求创立一个靶位点，并且依据重组的叠加组合在巨细方面存在束缚，详细束缚巨细现在尚不清楚。

在转基因位点的准确方位不重要的状况下，随机整合法和靶向基因叠加法也可以结合运用：在第一轮转化中，可以经过农杆菌介导转化，以随机的办法将基因叠加组合引进小麦，并且在叠加组合的一端设置一个靶位点；然后，这个位点可用于后续经过位点特异性重组酶进行叠加（图 3d）。

6. 应对知识产权格式

专利是由特定辖区的法令权威组织颁发的，自请求日起一般在 20 年内对一项创造享有独占权。专利颁发一切者对未经许可便从该项技能中获取经济利益的任何一方采纳法令行动的权力。虽然专利组织遵从的程序以及可被知识产权（IP）权力包含的产品和技能规模存在根本一致，但每个辖区都有各自的一套法令和标准。因而，在多个辖区寻求知识产权维护时，有必要进行逐案剖析。生物技能范畴的知识产权请求一般触及核苷酸和氨基酸序列、微生物与病毒，以及比如诱变、转化和安排培养等获取植物的人工办法。

2013 年，在美国 “分子病理学协会诉麦利亚德基因公司” 一案中，美国最高法院裁决，别离出的 DNA 序列不能被颁发专利，由于它们归于 “天然产品”。虽然如此，这并未阻挠 11 家组织在美国就 14 个已克隆的锈病抗性（R）基因的运用请求专利。随后，其间 9 项专利取得了同意（图 4a）。生物技能项目一般需求多年的研制和测验，随后还要阅历监管批阅阶段，这大大添加了产品面向商场的时刻。因而，一些最早克隆的锈病 R基因（例如，2008 年请求专利的 Lr34）的相关专利有或许在其商业开发运用之前就失效了（图 4b）。所以，一个强有力的知识产权维护战略可以减轻与这些专利及研制出资相关的商业危险。

在曩昔十年中，有关小麦锈病R基因的已宣布发现效果日益增多。2000 年至 2010 年间仅有 5 项研讨效果宣布，而 2011 年至 2020 年间则有 21 项研讨效果宣布。并且，仅在本十年的前三年，就现已描绘了 16 个新克隆的基因，这一趋势证明了相关效果数量不断上升，也意味着未来几年还会有更多的基因被克隆出来。这为选择最佳的候选基因来培养具有更强且耐久锈病抗性的小麦种类供给了令人振奋的机会。

但是，自 2009 年以来，几家参加克隆锈病 R基因的科研组织已为它们的发现效果寻求知识产权维护，然后导致了杂乱的知识产权格式（图 4）。53% 的已克隆基因在至少一个辖区已取得专利或有望取得专利（图 4c）。75% 具有知识产权状况的基来由相同的一两家组织持有或同享，其他基因则由别的八家组织操控或同享。在构建的基因叠加组合中平衡单个基因组合的有用性与知识产权格式所施加的束缚，关于商业化或公益性推行具有抗锈病工程性状的小麦种类来说，或许会构成严峻应战。相反，知识产权一切权也可作为一种办理东西，避免无效基因叠加组合的运用，然后延伸已克隆基因的运用期限。

图4. 小麦抗锈病基因的知识产权（IP）格式

7. 监管应战会使推行和商业化变得杂乱

自 1994 年转基因西红柿 “Flavr Savr”初次商业化以来，受抱负性状引进的推进，转基因作物的栽培量呈现了激增。在一切获批栽培的 390 个转基因事情中，63% 触及除草剂耐受性和抗虫性，而与非生物钳制耐受性、抗病性以及改进养分成分相关的性状加起来仅占 17%。

在这一充满期望的局势下，生物技能作物商业化推行的绵长进程中仍存在一个明显应战。在阿根廷，将 HB4 小麦面向农人田间耗时 15 年。相同，关于 “黄金大米 2 号”，从试验室研制到在菲律宾获批，历经了 16 年。这段时刻的很大一部分都用于对环境影响以及食物和饲料消费安全性进行详尽的危险评价。均匀而言，澳大利亚、新西兰、巴西、加拿大和美国的监管组织需求两年时刻来评价相关请求。比较之下，欧盟的这一评价进程或许耗时五年以上。这些评价侧重于分子特性判定、表型和农艺性状数据、新蛋白质及其表达水平的评价，以及食物和饲料的生化成分（包含养分和毒理学方面）。

除中国外，数据生成的职责一般落在开发者身上。为缩短商业化推行的时刻线（图 5），这种文件记载进程应与技能研制同步进行。例如，在转化后的初始阶段，新的抗锈病转基因植株可以针对特定病原体小种进行选择，这既可以作为技能可行性的证明，也有助于选择最有利的转化事情。一起，应提早搜集与刺进片段完整性、性状别离以及信使核糖核酸（mRNA）表达水平相关的分子数据，并将其用于转化事情选择以及后续的注册要求。

图5. 小麦转基因事情监管评价的数据搜集方案

一旦有满足的种子可用于田间试验，就可以在田间试验中将其体现与亲本野生型种子以及一系列惯例种类的种子进行比照。然后记载产值、产值构成要素、农艺和表型特征以及由病虫灾和非生物钳制要素形成的危害等参数。经过研讨从试验田搜集的节肢动物种群的变异性，可以评价生态彼此效果。田间评价的终究阶段可以在多个地址进行，包含对收成样本中转基因草料和籽粒的成分进行生化研讨。蛋白质特性判定触及对引进蛋白质的表达水平进行定量剖析，并研讨其致敏性、消化性和蛋白水解安稳性。终究，经过对试验啮齿动物进行毒性研讨，并结合牲畜的养分学研讨，来完善数据集。

8. “同一健康” 超级小麦有望完结

虽然热浪和干旱导致的小麦丢失常常占有新闻头条，但病虫灾对全球小麦产值的严峻影响却往往未遭到大众重视。育种公司投入很多资源经过惯例办法培养抗病种类。惋惜的是，这束缚了针对其他相同要害性状的育种才能。

基因工程构建的基因叠加组合为防控许多病虫灾、减轻环境钳制影响以及增强要害养分性状供给了直接的处理方案（图 6）。在这些根本问题得到处理后，育种作业便可聚集于对其他杂乱的多基因性状进行精密调整，终究前进产值和终端运用质量。但是，以一种有利于在育种方案中进行高效办理的办法导入大型多基因叠加组合，却代表着技能工程方面的应战。展望未来，运用人工微型染色体来传递定制化的基因组合或许可以处理这一瓶颈问题。

图6. “同一健康” 超级小麦概念

在这一充满期望的远景下，与针对转基因植物的严厉监管结构保持一致至关重要，要保证上游的研讨和工程作业可以助力下流的育种以及转基因事情的解除管制。三十多年前拟定的关于转基因作物的防备准则，应当依据这期间堆集的经历加以修订。此外，已克隆的R基因所在的杂乱知识产权格式，引发了人们关于这一法令结构终究能在多大程度上发生好处，而非阻挠新技能运用的疑问。不过，人们也供认，知识产权可被用于束缚不负职责地推行仅依托少量基因的抗性小麦种类。

对天然和农业生态体系的深化了解有必要融入到减轻农业影响的新战略拟定傍边。这种交融可以促进土壤、作物、水源以及荒地的健康，符合“同一健康” 理念，使今世人和子孙后代都能从中获益。在此布景下，社会可以从依托化石燃料的饮食形式转向依托阳光保持的饮食形式，以完结可继续的未来。

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（转自：小麦研讨联盟）

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